Scriptase II FastGene

Détails

Enzyme d’ingénierie

Les transcriptases inverses génétiquement modifiées permettent la synthèse d’ADNc à partir de très faibles quantités d’ARN. Des mutations sont insérées dans le domaine RNase H de la transcriptase inverse MuLV. Par conséquent, en ne dégradant pas l’ARN pendant la synthèse du premier brin, un rendement plus élevé en ADNc entier est obtenu. De plus, une stabilité thermique plus élevée augmente la robustesse de l’enzyme.

La Scriptase II FastGene^® est exactement l’une de ces enzymes d’ingénierie. Avec sa mutation dans le domaine RNase H et sa stabilité thermique supérieure, elle constitue le choix optimal pour des utilisations plus complexes, telles que des RT-qPCR et du NGS.

Applications

• Quantification de l’expression des gènes
• RT-qPCR
• Séquençage NGS
• Faible concentration d’ARN
• Matrices complexes

Activité RNase H plus faible pour des ADNc plus longs

La Scriptase II FastGene^® a un domaine RNase H modifié. L’ARN n’est donc pas dégradé et sert de matrice pour des ADNc plus longs, ce qui permet d’obtenir une taille de fragments pouvant atteindre 12 kpb.

Enzymes d’ingénierie – optimisées pour la qPCR

La Scriptase II FastGene^® fournit des matrices ADNc de qualité supérieure pour ses utilisations en aval, par exemple pour de la qPCR et du NGS. L’ADNc entier obtenu donne une image complète du gène et permet de mettre en évidence des modifications, comme des variants d’épissage.

Comparaison de différents résultats de PCR

– PCR multiplexe

Fig. 1 : Comparaison de la PCR multiplexe utilisant l’ADNc produit par l’enzyme SS-II du concurrent I et la Scriptase II FastGene^® à 42 et à 50 °C.

– qPCR

Fig. 2 : Comparaison des résultats de qPCR avec des amorces pour la GAPDH et l’ADNc produit par l’enzyme SS-II du concurrent I, et la Scriptase II FastGene^® à 42 °C, en utilisant différentes concentrations initiales d’ARN.

Fig. 3 : Comparaison des résultats de qPCR avec des amorces pour YWHAZ et l’ADNc produit par l’enzyme SS-II du concurrent I, et la Scriptase II FastGene^® à 42 °C, en utilisant différentes concentrations initiales d’ARN.

Documents

FAQ

L’étape 5 min 65 °C du protocole n’est pas mentionnée dans le manuel de Scriptase II ReadyMix. Quel est le but de cette étape et puis-je la sauter si je n’utilise que la seule enzyme Scriptase II ?

L’étape à 65 °C permet d’éviter la structure secondaire des molécules d’ARN. L’ARN est une molécule simple brin qui forme une structure en épingle à cheveux avec elle-même pour atteindre une meilleure stabilité. Cette étape est en quelque sorte une étape de sécurité, mais dans de nombreux cas, elle n’est pas nécessaire. Vous pouvez donc l’éliminer si vous obtenez de bons résultats dans les deux cas.

Quelle est la plage de température optimale pour Scriptase Basic et Scriptase II ?

La plage de température optimale pour les Scriptases est comprise entre 42 °C et 50 °C. Une température supérieure à 50 °C n’est pas recommandée.

Est-ce que je peux utiliser le Kit Scriptase II ADNc avec une grosse quantité d’ARN (2,5 µg / 20 µL) ?

Nous recommandons un maximum d’1 µg. La raison : les gènes très exprimés seront proportionnellement surreprésentés dans une concentration aussi élevée. Signifiant que les chances de trouver un ARNm très concentré sont plus hautes que pour les ARNm à faible concentration. Avec 1 µg, la quantité d’enzyme par ARNm sera bien plus haute, garantissant la RT totale de chaque ARNm.

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