Kit Scriptase II ADNc FastGene (100)

Détails

Enzyme d’ingénierie

Les transcriptases inverses génétiquement modifiées permettent la synthèse d’ADNc à partir de très faibles quantités d’ARN. Des mutations sont insérées dans le domaine RNase H de la transcriptase inverse MuLV. Par conséquent, en ne dégradant pas l’ARN pendant la synthèse du premier brin, un rendement plus élevé en ADNc entier est obtenu. De plus, une stabilité thermique plus élevée augmente la robustesse de l’enzyme.

La Scriptase II FastGene^® est exactement l’une de ces enzymes d’ingénierie. Avec sa mutation dans le domaine RNase H et sa stabilité thermique supérieure, elle constitue le choix optimal pour des utilisations plus complexes, telles que des RT-qPCR et du NGS.

Applications

• Quantification de l’expression des gènes
• RT-qPCR
• Séquençage NGS
• Faible concentration d’ARN
• Matrices complexes

Activité RNase H plus faible pour des ADNc plus longs

La Scriptase II FastGene^® a un domaine RNase H modifié. L’ARN n’est donc pas dégradé et sert de matrice pour des ADNc plus longs, ce qui permet d’obtenir une taille de fragments pouvant atteindre 12 kpb.

Enzymes d’ingénierie – optimisées pour la qPCR

La Scriptase II FastGene^® fournit des matrices ADNc de qualité supérieure pour ses utilisations en aval, par exemple pour de la qPCR et du NGS. L’ADNc entier obtenu donne une image complète du gène et permet de mettre en évidence des modifications, comme des variants d’épissage.

Comparaison de différents résultats de PCR

– PCR multiplexe

Fig. 1 : Comparaison de la PCR multiplexe utilisant l’ADNc produit par l’enzyme SS-II du concurrent I et la Scriptase II FastGene^® à 42 et à 50 °C.

– qPCR

Fig. 2 : Comparaison des résultats de qPCR avec des amorces pour la GAPDH et l’ADNc produit par l’enzyme SS-II du concurrent I, et la Scriptase II FastGene^® à 42 °C, en utilisant différentes concentrations initiales d’ARN.

Fig. 3 : Comparaison des résultats de qPCR avec des amorces pour YWHAZ et l’ADNc produit par l’enzyme SS-II du concurrent I, et la Scriptase II FastGene^® à 42 °C, en utilisant différentes concentrations initiales d’ARN.

Documents

FAQ

Quelle concentration est recommandée pour des amorces spécifiques d’un gène avec LS63 ?

Nous recommandons l’utilisation de 15 à 20 pmol pour des amorces spécifiques d’un gène.

Quel est l’objectif de l’étape à 42 °C pendant 2 min, et le rendement diminuera-t-il significativement si je saute cette étape ? Si j’utilise une amorce oligo dT, puis-je sauter cette étape ?

Le but de cette étape est l’hybridation de l’amorce. Pour l’oligo dT, il est généralement recommandé d’effectuer une étape d’hybridation à 42 °C pendant 2 minutes, car son Tm est faible.

Le rendement n’est pas influencé si la quantité de matrice est suffisante et si les amorces fonctionnent correctement (bien conçues). Dans ce cas, vous pouvez ignorer l’étape. Mais si la quantité de matrice est faible et que les amorces ne sont pas optimisées, nous nous attendons à ce que le rendement soit affecté.

Dans le protocole, l’étape d’hybridation pour oligo dT est une standard. Pour certaines cibles, une température de 40 °C pendant 2 minutes ou de 37 °C pendant 2 minutes, etc., pourrait être meilleure pour des expériences en temps réel qu’une température de 42 °C. Cela signifie qu’il est possible que vous deviez optimiser de manière empirique la température de réaction, le temps et les étapes pour votre cible.

Est-ce que je peux utiliser le Kit Scriptase II ADNc avec une grosse quantité d’ARN (2,5 µg / 20 µL) ?

Nous recommandons un maximum d’1 µg. La raison : les gènes très exprimés seront proportionnellement surreprésentés dans une concentration aussi élevée. Signifiant que les chances de trouver un ARNm très concentré sont plus hautes que pour les ARNm à faible concentration. Avec 1 µg, la quantité d’enzyme par ARNm sera bien plus haute, garantissant la RT totale de chaque ARNm.

Est-ce que l’Enzyme est influencée par du DEPC ?

Si le DEPC n’est pas complètement enlevé, cela peut inhiber toute réaction enzymatique, incluant la Scriptase II.

Demande de produit

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